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Tipo: Trabalho de Conclusão de Curso
Título: Utilização da técnica de High Resolution Melting (HRM) para identificação de diferentes haplótipos de Varroa destructor
Autor(es): Gonçalves, Lays Soares
Primeiro Orientador: Boldo, Juliano Tomazzoni
1° Membro da banca: Sassi, Adriana Koslovski
2° Membro da banca: Delgado Cañedo, Andrés
Resumo: O ácaro Varroa destructor distribuiu-se pelo mundo parasitando abelhas da espécie Apis melífera; e atualmente é considerado a principal ameaça para a apicultura. Ele é responsável pelos sintomas clínicos da varrose. Estudos sobre a variabilidade genética do ácaro V. destructor, demonstraram que a virulência da varrose também está relacionada a diferentes haplótipos do ectoparasito. Com base na sequência do gene da citocromo C oxidase (COI) presente no DNA mitocondrial, pesquisadores dividiram Varroa jacobsoni em duas espécies: V. jacobsoni e V. destructor. Mesmo dentro da espécie V. destructor, existem variações na sequência do gene supracitado, o que permite a diferenciação da espécie nos haplótipos Japonês (J) e Coreano (K). Esta diferenciação não é apenas genética, mas também em grau de virulência. O haplótipo K tende a ser mais virulento que o haplótipo J, fato importante para futuros programas de monitoramento e possível controle do ácaro. É possível observar a diferenciação dos haplótipos pela clivagem dos produtos de amplificação do gene COI. Ambos os haplótipos possuem sítio de clivagem para a enzima XhoI, mas apenas o haplótipo J possui sítio para a enzima SacI. Contudo, o tempo necessário para análise é alto, mostrando-se inapropriado quando analisamos várias amostras simultaneamente. Assim, propomos a utilização da técnica de High Resolution Melting (HRM), que visa distinguir estes polimorfismos observando-se a curva de desnaturação da dupla fita de DNA. Este trabalho tem como objetivo estabelecer a técnica de HRM para identificação dos dois haplótipos citados, comparando-a com a metodologia padrão utilizada. As sequências de DNA do gene COI de V. destructor foram selecionadas em função das regiões polimórficas dos haplótipos J e K; os fragmentos selecionados foram sintetizados artificialmente (gBlocks, Integrated DNA Technologies). A partir destas sequências foram desenhados primers para HRM e para reações de clivagem. Os fragmentos artificiais foram submetidos à reação de PCR para padronização das condições experimentais, utilizando primers para HRM e para posterior clivagem. Após a reação de PCR, os fragmentos amplificados foram submetidos a reação de clivagem com as enzimas de restrição SacI e XhoI. Após a padronização, procedemos para as reações de clivagem utilizando as enzimas de restrição SacI e XhoI tanto para os produtos de amplificação oriundos das amostras de DNA sintético quanto para de DNA de varroas amostradas em colmeias de A. melífera. Os resultados obtidos foram observados por eletroforese em gel de agarose. Após, as amostras foram submetidas a reação de HRM. Observamos que houve a amplificação dos amplicons com o tamanho e com o padrão de clivagem esperados. Também foi identificado o haplótipo da amostra ambiental, que foi classificado como haplótipo K. Na análise de HRM, as duas amostras que compreendem a variante 2 (K) demonstram um comportamento padrão, com curvas de desnaturação semelhantes, diferenciando-se apenas na intensidade. Concluímos que este método pode ser potencialmente utilizado para as análises de segregação dos haplótipos K e J. A partir do uso desta técnica a análise torna-se mais rápida e precisa, podendo ser utilizada em projetos de avaliação de distribuição de haplótipos, cujos resultados podem ser utilizados para o monitoramento de infestações e o controle deste parasito.
Abstract: The Varroa destructor mite has spread worldwide parasitizing bees of the species Apis mellifera, and is currently considered the major threat to beekeeping. It is responsible for the clinical symptoms of varrose. Studies on the genetic variability of V. destructor mite showed that the virulence of varrose is also related to different haplotypes of the ectoparasite. Based on the sequence of the cytochrome C oxidase gene (COI) present in the mitochondrial DNA, researchers divided Varroa jacobsoni into two species: V. jacobsoni and V. destructor. Even within the species V. destructor, there are variations in the sequence of the above-cited gene, which allows differentiation of the species Japanese haplotypes (J) and Korean (K) haplotypes. Such differentiation is more than a genetic trait. Both haplotypes differ in their virulence, as the K haplotype is more virulent than J haplotype. It is possible to identify the haplotypes with PCR reaction followed by cleavage reaction. Both COI gene amplicons have cleavage site for XhoI enzyme, but only the J haplotype has cleavage site for the SacI restriction enzyme site for the enzyme. However, the time required in this technique is high, and hampers high-throughput analysis. Therefore, we propose the use of High Resolution Melting technique (HRM), which aims to distinguish these polymorphisms observing the denaturation curve of double-stranded DNA, for fast and large-scale analysis. This study aims to establish the HRM technique in order to distinguish the K and J haplotypes, and compare the results with the standard method used. The DNA sequences of the V. destructor COI gene were selected based on haplotype of polymorphic regions J and K; the selected fragments were synthesized artificially (gBlocks, Integrated DNA Technologies). From these sequences, primers were designed for HRM and cleavage reactions. Artificial fragments were subjected to PCR for standardization of experimental conditions using primers for HRM and subsequent cleavage. After the PCR reaction, the amplified fragments were subjected to cleavage reaction with SacI and XhoI restriction enzymes. After standardization, cleavage reactions were conducted using the restriction enzymes SacI and XhoI for both amplification products from the synthetic DNA and environmental samples. The results obtained were observed by electrophoresis in agarose gel. After, the samples were subjected to HRM. The resulting amplicons presented the expected size and cleavage pattern. Was also identified the environmental sample haplotype, which has been identified as K haplotype. In HRM haplotype analysis, the two samples comprising the variant 2 (K) showed the same melting curve pattern, differing only in the intensity. We conclude that this method could potentially be used for V. destructor haplotypes J and K identification. This technique improves the current method for J and K haplotypes identification, rendering a more fast and precise method, which can be used for V. destructor monitoring and control programs.
Palavras-chave: Varroa destructor
Apis mellifera
Haplótipos
HRM
Varrose
haplotypes
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
Idioma: por
País: Brasil
Editor: Universidade Federal do Pampa
Sigla da Instituição: UNIPAMPA
Campus: Campus São Gabriel
Citação: GONÇALVES, Lays Soares. Utilização da técnica de High Resolution Melting (HRM) para identificação de diferentes haplótipos de Varroa destructor. 2015. 35 f. Trabalho de conclusão de Curso ( Curso de Biotecnologia). Universidade Federal do Pampa. Campus São Gabriel. São Gabriel. 2015.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://dspace.unipampa.edu.br:8080/jspui/handle/riu/4384
Data do documento: 22-Jan-2015
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