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Tipo: Trabalho de Conclusão de Curso
Título : Desenvolvimento e validação de um protocolo de extração de RNA de células em cultura livre de fenol
Autor(es): Costa, Hudson Marques Paula
Primeiro Orientador: Delgado Cañedo, Andrés
1° Membro da banca: Boldo, Juliano Tomazzoni
2° Membro da banca: Franco, Jeferson Luiz
Resumo: O ácido ribonucleico (RNA) é um polímero de ribonucleotídeos encontrado no interior de células tanto eucarióticas como procarióticas e está quase sempre relacionado à expressão gênica. Para se obter resultados confiáveis em estudos de expressão gênica, é necessário extrair um RNA puro e íntegro. Técnicas para extração de RNA de alta qualidade vem sendo desenvolvidas e refinadas e as mais utilizadas atualmente são as de colunas cromatográfica de sílica presentes em kits comerciais e a técnica de tiocianato de guanidina – fenol – clorofórmio, utilizada em reagentes como o Trizol comercializado pela Thermofisher ou o TRI Reagent comercializado pela Sigma-Aldrich, entre outros. As duas técnicas extraem um RNA de alta pureza e qualidade. No entanto, solventes orgânicos como o fenol são tóxicos e interferem negativamente na quantificação do RNA por absorver luz UV no mesmo comprimento de onda do RNA. Colunas cromatográficas limitam a extração de RNA à quantidade que cada uma suporta além de tornar um método de alto custo quando se tem um grande número de amostras. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de baixo custo de extração de RNA de alta qualidade a partir de células em cultura dispensando o uso do sistema orgânico FenolClorofórmio. O RNA foi extraído de células K562 (entre 1 e 3 x 106 células por reação) cultivadas em meio RPMI 1640, seguindo procedimento padrão. As células foram separadas do meio de cultura por centrifugação e ressuspendidas em uma solução tampão (pH 7,8) contendo 140 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de TRIS. As células foram fracionadas em tubos de reação de 1,5 mL e lisadas adicionando 0,2 volumes de DTT 2 M e 0,1 volume de solução de NP-40 (10% v/v) em vortex. Os núcleos foram removidos por centrifugação e o sobrenadante contendo o RNA foi submetido a desnaturação proteica com tiocianato de guanidina na concentração final de 1 M. Posteriormente, um processo de purificação do RNA foi realizado por salting out com sulfato de amônio na concentração final de 1 M. Finalmente, o RNA foi precipitado em 0,1 volume de acetato de sódio e 0,6 volumes de isopropanol a -20 ºC, o precipitado foi lavado com isopropanol 50 % e eluído em água ultrapura. Como controle foi utilizado RNA extraído por colunas cromatográficas de kit comercial seguindo orientações do fabricante. As extrações foram realizadas no mesmo dia com a mesma quantidade de células e nas mesmas condições. Foram realizadas análises de eletroforese em gel de agarose não desnaturante, quantificação de proteínas por Bradford, RT-PCR e qRT-PCR para avaliar o RNA extraído pelo método TGSA (tiocianato de guanidina – sulfato de amônio; descrito neste trabalho) em comparação com o RNA extraído por coluna cromatográfica. As análises demonstraram que o método TGSA permite extrair RNA de alta qualidade com características similares às apresentadas pelo RNA extraído com colunas cromatográficas. Além disso, foram feitos orçamentos de reagentes necessários para extração de RNA com método TGSA e um comparativo de preços com os kits comerciais. O método de TGSA custou R$ 1,61 por reação com reagentes de vários fornecedores e R$ 2,66 por reação com todos os reagentes da empresa Sigma Aldrich. Isso representa um valor aproximadamente 8,4 vezes inferior ao necessário para realizar a extração de RNA de alta qualidade com o método de menor custo na presente data (PureLink RNA mini kit – Thermo Fishier).
Resumen : Ribonucleic acid (RNA) is a polymer of ribonucleotides found within prokaryotic and eukaryotic cells and it’s almost always related to gene expression. To get trustworthy results in gene expression research, extract a high purity and integrity RNA is necessary. Many techniques to isolate a high-quality RNA has been developed and improved and the most utilized nowadays are silica chromatography columns present in commercial kits and guanidinium thiocyanate - phenol – chloroform extraction technique, used in reagents such as Trizol marketed by Thermofisher or TRI Reagent marketed by Sigma - Aldrich, among others. Both techniques isolate a high purity and quality RNA. However, organic solvents like phenol are very toxic and interfere negatively in RNA quantification by absorbing UV in the same wavelength than RNA. Chromatography columns limits RNA extraction to the amount of each column can support and become an expensive method in experiments with a large number of samples. The objective of this work was developing an inexpensive protocol for a high-quality RNA isolation from cultured cells dispensing the use of organic system phenol-chloroform. RNA was isolated from k562 cultured cells (between 1 and 3 x 106 cells per reaction) in RPMI 1640 medium following standard procedure. Cells were separated from the culture medium by centrifugation and resuspended in a buffer solution (pH 7.8) containing 140 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM TRIS. The cells were fractionated in 1.5 mL reaction tubes and lysed by adding 0.2 volumes of 2 M DTT and 0.1 volume of NP-40 solution (10% v / v) and vortexing. The nuclei were removed by centrifugation and the supernatant containing the RNA was subjected to protein denaturation with guanidine thiocyanate at the final concentration of 1 M. The purification of RNA was performed by salting out with ammonium sulfate at the final concentration of 1 M. The RNA was precipitated with 0.1 volume of sodium acetate and 0.6 volumes of isopropanol at -20 ° C. The precipitated was washed with 50% isopropanol and eluted in ultrapure water. As control, RNA was extracted by columns with commercial kit following manufacturer's instructions. Extractions were performed on the same day with the same number of cells under the same conditions. Non-denaturing agarose gel Electrophoresis, Bradford, RT-PCR and qRT-PCR analyses were performed to evaluate the RNA extracted by the TGSA (guanidine thiocyanate - ammonium sulfate, described in this work) in comparison to RNA extracted from the chromatographic column. The analysis showed that the TGSA method allows the extraction of high-quality RNA with characteristics similar to those presented by the RNA extracted with chromatographic columns. In addition, required reagents budget for RNA isolation with TGSA method was made and a comparison of prices with commercial kits also. The TGSA method cost R$ 1.61 per reaction with reagents from several suppliers and R $ 2.66 per reaction with all reagents from Sigma Aldrich. This represents a value approximately 8.4 times lower than that required to perform the extraction of high quality RNA with the cheaper method (PureLink RNA mini kit - Thermo Fishier).
Palabras clave : Tiocianato de guanidina
Sulfato de amônio
Salting out
RNA
Guanidinium thiocyanate
Ammonium sulfate
CNPQ: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
Idioma: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Editorial : Universidade Federal do Pampa
Sigla da Instituição: UNIPAMPA
Campus: Campus São Gabriel
Citación : COSTA, Hudson Marques Paula. Desenvolvimento e validação de um protocolo de extração de RNA de células em cultura livre de fenol. 45 f. Monografia (Curso de Biotecnologia). Universidade Federal do Pampa. São Gabriel. 2017.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI : http://dspace.unipampa.edu.br:8080/jspui/handle/riu/3867
Fecha de publicación : 13-nov-2017
Aparece en las colecciones: Biotecnologia



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