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Tipo: Trabalho de Conclusão de Curso
Título : Clonagem e expressão da transposase de mos1 em diferentes cepas de escherichia coli bl21 (de3)
Autor(es): Machado, Laís Ceschini
Primeiro Orientador: Pinto, Paulo Marcos
Resumo: Elementos transponíveis (TE) são sequencias móveis de DNA presente na maioria dos genomas, que são capazes de se mover de um determinado locus para outro. Estes elementos estão distribuídos em todos os principais ramos da vida, sua diversidade e características biológicas intrínsecas fazem uma considerável fonte de mudanças genéticas durante a evolução da maioria das espécies. A superfamilia mariner de trasnposons de DNA é provavelmente a mais difundida de transposons na natureza, e caracteriza-se por possuir 2400 pares de bases com uma única região codificadora da enzima transposase. O elemento transponível mos1, que é classificado dentro da superfamilia de transposons mariner, e estes são amplamente distribuídos na família Drosophilidae. O estudo de elementos transponíveis ainda é muito sucinto, e o conhecimento sobre sua transposase é pouco conhecido à nível molecular. Com isto este trabalho busca determinar condições ideais para otimizar o sistema de expressão e purificação para obtenção da transposase do elemento mariner mos1, em diferentes cepas de Escherichia coli BL21 D3. Foi subclonado em vetor plasmidial de expressão pGEX-4T1, a open reading frame (ORF) do gene da transposase. Posteriormente foi feito testes de expressão e solubilização em 3 concentrações de Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (0,1 mM; 0,5 mM e 1,0 mM) e duas temperaturas 30°C e 37°C, onde o IPTG funciona como um indutor para o promotor para que ocorra a expressão da proteína heteróloga. A expressão da transposase, em fusão com a Glutationa S- transferase (GST) (intrínseca ao plasmídeo) foi identificada por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) apresentando a massa molecular similar à predita de aproximadamente 67kDa. Com a aquisição destes resultados obtidos pelo SDSPAGE, notou-se uma menor eficácia na expressão heteróloga na cepa BL21 D3 GROE. Além de constatar uma diminuição na expressão em todas as cepas na temperatura de 30ºC. Os testes de solubilização não apresentaram diferenças significativas nas diferentes temperaturas e concentrações de IPTG. Com esses resultados das expressões, irá proceder-se com a purificação e a produção de anticorpos contra essa proteína para maior análises moleculares e funcionais.
Resumen : Transposable elements (TE) are mobile DNA sequences present in most genomes, which are able to move from one locus to another. These elements are distributed in all major branches of life, their diversity and intrinsic biological characteristics makes a considerable source of genetic changes during the evolution of most species. The DNA transposon mariner superfamily is probably the most widespread of transposons in nature, and is characterized by having 2400 base pairs with a single coding region of the enzyme transposase. The transposable element mos1, which is classified within the superfamily of transposons mariner, and these are widely distributed in the family Drosophilidae. The study of transposable elements is still very succinct, and the knowledge about its transposase is little known at the molecular level. This work seeks to determine optimal conditions to optimize the expression and purification system to obtain the transposase of the mariner element MOS1 in different strains of Escherichia coli BL21 D3. It was subcloned into pGEX4T1 expression plasmid vector, the open reading frame (ORF) of the transposase gene. Subsequently, expression and solubilization tests were performed on 3 concentrations of Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (0.1 mM, 0.5 mM and 1.0 mM) and two temperatures of 30°C and 37°C, Where the IPTG functions as an inducer to the promoter for expression of the heterologous protein. Expression of transposable fusion in Glutathione S-transferase (GST), was identified by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) having the predicted molecular mass of approximately 67kDa. With the acquisition of these results obtained by SDSPAGE, a lower efficacy was observed in the heterologous expression in the BL21 D3 GROE strain. In addition, there was a decrease in expression in all strains at a temperature of 30ºC. The solubilization tests showed no significant differences in the different temperatures and concentrations of IPTG. With these results from the expressions, we will proceed with the purification and production of antibodies against this protein for further molecular and functional analyzes.
Palabras clave : DNA
Cloning
Transposable elements
Editorial : Universidade Federal do Pampa
Tipo de acesso: Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
Licença: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
URI : http://dspace.unipampa.edu.br/jspui/handle/riu/1395
Fecha de publicación : 9-dic-2016
Aparece en las colecciones: Biotecnologia

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