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metadata.dc.type: Dissertação
Title: Caracterização fitoquímica e neurofarmacológica de compostos inseticidas isolados de Prasiola crispa (Lightfoot) Kützing (1843)
metadata.dc.creator: Lorensi , Graziela Holkem
metadata.dc.contributor.advisor1: Dal Belo , Cháriston André
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Pinto , Paulo Marcos
metadata.dc.contributor.referee1: Mendez, Andreas Sebastian Loureiro
metadata.dc.contributor.referee2: Vinadé, Lúcia Helena do Canto
metadata.dc.description.resumo: Organismos adaptados a ambientes extremos como a Antártica tendem a apresentar uma constituição única em termos de metabólitos secundários. Desta forma, estudos que visem à elucidação de efeitos biológicos de organismos vegetais oriundos destas regiões são relevantes do ponto de vista biotecnológico. Este trabalho investigou o mecanismo envolvido na atividade inseticida do extrato bruto da Prasiola crispa uma alga oriunda de áreas de degelo da Antártica, em modelos neurofisiológicos de baratas da espécie Nauphoeta cinerea. Também foi investigado o mecanismo de ação dos compostos bioativos oriundos do material vegetal, relacionado a essa atividade. A alga foi coletada, próxima à região da estação Polonesa Arctowski, na Baia do Almirantado. O mecanismo de toxicidade do extrato hexânico da alga Prasiola crispa foi demonstrado inicialmente através de avaliações toxicológicas em ensaios de letalidade para a determinação da DL50. Foram realizados ensaios bioquímicos para determinação da atividade da enzima AChE sobre o homogeinizado de cérebro de baratas. Também foram usados modelos biológicos in situ e in vivo com o intuito de se verificar a atividade do extrato sobre diferentes sistemas fisiológicos desses animais como o sistema cardiovascular, sistema nervoso periférico e o sistema nervoso central. Nesse sentido, usando à técnica do coração semi-isolado de baratas in situ, a de músculo coxal abdutor-metatoráxico in vivo e a técnica para a medida da atividade de grooming in vivo. O extrato hexânico de Prasiola crispa (HPC) foi preparado de acordo com a técnica fitoquímica convencional. A análise fitoquímica preliminar foi feita usando-se a cromatografia de camada delgada (CCD). Assim, os ensaios para a determinação da dose letal mínima (DL50) nas concentrações 100, 200, 400 e 800µg/g de animal, demonstraram que a dose de 400μg/g ocasionou a morte de 50% dos animais, sendo esta considerada a DL50 para Nauphoeta cinerea, 24h após a administração do composto (n=10 em triplicata *p≤0,05). Os ensaios para a medida da atividade da AChE, demonstraram que o HPC 100, 200, 400 e 800µg/g de animal, não inibe significativamente essa enzima (p≥0.05, n=5 em triplicata). A avaliação dos efeitos do extrato 100, 200, 400 e 800µg/g de animal, sobre a frequência cardíaca da barata, demonstrou uma atividade cardiotóxica que foi tempo-dependente. Quando a dose do HPC 100µg/g foi ensaiada houve um efeito cronotrópico positivo não significativo. Os ensaios com as doses sucessivas induziram um efeito cronotrópico negativo, que foi máximo para a dose de (800μg/g) o efeito foi de 35±3bat./min (n=6, *p≤0,05). A obtenção dos registros da força de contração muscular em animais tratados com o HPC 100, 200, 400 e 800µg/g de animal, resultou em um bloqueio neuromuscular progressivo dose e tempo-dependente. Em todos os registros ficou evidente o aparecimento de contrações espontâneas após 15-30min do tratamento com HPC. Nessa série de ensaios a dose de 800µg/g do HPC induziu o maior nível de inibição da força de contração muscular, que foi de 100% em 120min de registros (n=6, *p≤0,05). O pré-tratamento dos animais com cloral hidratado 10µg/g de animal, um bloqueador do receptor de N-metil-d-aspartato (NMDA), aumentou o tempo para o bloqueio das contrações musculares em 50%, e inibiu o aparecimento de contrações espontâneas. O pré-tratamento com a bicuculina 2,5µg/g de animal, um bloqueador dos receptores GABA, inibiu parcialmente o efeito bloqueador neuromuscular induzido pelo HPC 800µg/g (n=6, *p≤0,05). A análise do comportamento de grooming, que é caracterizado pela limpeza das pernas e antenas pelo animal, demonstrou também um efeito tempo-dependente. Nesses ensaios os valores para o grooming com solução salina foram de 153±8s/30min para pernas 75±5s/30min para antenas. Quando o DMSO 10% foi ensaiado não houve alteração das respostas, em relação ao controle salina, para o grooming de antenas e uma leve diminuição não significativa do grooming de pernas. A administração do HPC nas concentrações de 100, 200, 400 e 800μg/g de animal, induziu um aumento significativo na taxa de grooming de antenas e pernas para a menor dose que foi de 390±5s/30min para as antenas e 395±5s/30min 8 para as pernas, respectivamente (*p≤0.05). Quando as maiores doses foram ensaiadas houve uma diminuição nas respostas de grooming que foi máxima para o de antenas e pernas, culminando com a extinção da atividade com a dose de 800μg/g (n=30, *p≤0.05). Na determinação dos compostos químicos do HPC feita por ensaios de Ressonância Magnética Nuclear foram identificados três cristais com alto grau de pureza caracterizado como fitoesteróis: β-sitosterol (24α-etil-colest-5-enol) (m/z 414,71), Campesterol (24α-metil-colest5-enol) (m/z 400.68) e Stigmasterol (24α-etil-colest- 5,22-dienol) (m/z 412,69). Dos três compostos identificados, o β-sitosterol foi o mais ativo em induzir neurotoxicidade sobre o sistema nervoso periférico. Em conjunto os resultados apresentados nesse trabalho, demonstram que o extrato hexânico de Prasiola crispa induz atividade entomotóxica em modelo de Nauphoeta cinerea. Esse efeito tóxico seria prevalente sobre o sistema nervoso periférico. A indução de alterações sobre a taxa de grooming demonstra que os compostos bioativos presentes no extrato atingem o sistema nervoso central do inseto produzindo alterações complexas nessa área. O efeito cardiotóxico contribui para o desenvolvimento do efeito letal induzido pelo extrato em baratas. A determinação de compostos fitosteróis reforçam que esses compostos devam estar associados aos efeitos tóxicos observados no extrato. Ensaios fitoquímicos futuros para a determinação de novos compostos presentes no extrato poderão contrubuir para a elucidação da atividade entomotóxica.
Abstract: Organisms adapted to extreme environments such as Antarctica, tend to present a unique constitution in terms of secondary metabolites. Thus, studies aiming the elucidation of biological activity of vegetal organisms from these regions are relevant in terms of biotechnology. The aim of this work was to investigate the mechanism underlying the entomotoxic activity of Prasiola crispa seaweed from Antarctica mealting iced areas whole extract in neurophysiological models of Nauphoeta cinerea cockroaches. The mechanisms of the vegetal extract isolated bioactive compounds that was related to the entomotoxic activity were also studied. The seaweed was collected next to the Polish station Arctowski, at Almirantado bay. The toxic mechanism of the hexanic extract of Prasiola crispa, was initially demonstrated through toxicological assessments of lethality assays of LD50. Biochemical assays were also performed to determine the acetylcholinesterase (AChE) enzime activity on the cockroaches’ brain homogenate. It was also used in vivo and in situ biological models of cockroaches, in order to assess the extract’s activity on the different insect physiological systems, such as the cardiovascular system, the peripheral nervous system and the central nervous system. To accomplish this, we have used the cockroach in situ semi-isolated heart technique, the the coxal methatoraxic-abdutor nerve-muscle preparation in vivo and the measurement of grooming activity in vivo. The hexanic extract of Prasiola crispa (HPC) was prepared according to the conventional phytochemical technique. The phytochemical preliminar analysis was performed through thin layer chromatography (TLC). Thus, the assays to determine the minimum lethal dose (LD50) at 100, 200, 400 and 800 µg/g of animal weight, demonstrated that the dose of 400 µg/g induced 50% lethality, that was considered the LD50 for Nauphoeta cinerea, 24h after the adminstration of the compound (n= 10 in triplicate *p≤0,05). The assays for AChE activity showed that the HPC 100, 200, 400 and 800µg/g of animal weight, does not inhibit significantly this enzyme (p≥0.05, n=5 in triplicate). The biological activity of HPC 100, 200, 400 e 800 µg/g of animal weight on cockroach heart rate, showed a time-dependent cardiotoxic activity. When the HPC 100 µg/g was assayed, a nonsignificative positive chronotropic effect was observed. With the higher doses there were a progressive negative chronotropic effect that was maximum at 800 µg/g 35±3 beat./min; (n=6,*p≤0,05). The recordings of cockroach neuromuscular twich-tension with HPC 100, 200, 400 e 800 µg/g animal, showed a progressive dose and time-dependent neuromuscular blockade. Spontaneous twiches were detected 15-30min after HPC treatment in all experiments. In this assayes, HPC 800 µg/g induced the highest level of neuromuscular blockade 100% within 120min recordings (n=6, *p≤ 0,05). On these preparations the previous treatment with chloral hydrate 10µg/g animal, an N-methyl-d-aspartate blocker, increased the time for 50% neuromuscular blockade, and also inhibited the appearance of spontaneus twiches. The pretreatment with bicuculine 2.5 µg/g of animal weight a GABA receptor blocker, partially inhibited the neuromuscular blockade activity induced by HPC 800µg/g (n=6, p≤0,05). The animal grooming behavior analysis which is the leg and antennae cleaning behavior, also showed a time-dependent effect. In these assays the values for grooming in saline-treated animals was 153±8s/30min for the legs 75±5s/30min for the antennas, respectively. When DMSO 10% was assayed, no changes in the responses was observed in 10 the antenna grooming, and a slight but not significant decrease in the leg grooming was detected. HPC 100, 200, 400 and 800 µg/g of animal weight treatment induced a significant increase in the legs and antennas grooming, of 390 ±5s/30min for antenas and 395 ±5s/30min for legs, on the smallest tested dose (*p≤0,05). When higher HPC doses were assayed, there was a progressive decrease on grooming responses, that was maximum for antennas and legs and resulted in the extinction of grooming activity at 800μg/g dose (n=30, *p≤0.05). The determination of HPC chemical compounds by Nuclear Magnetic Rensonance (RMN), showed three crystals with high purity that were characterized as phytosterols: β-sitosterol (24α-etil-colest-5-enol) (m/z 414,71), campesterol (24α-metil-colest-5-enol) (m/z 400.68) e stigmasterol (24α-etil-colest- 5,22-dienol) (m/z 412,69). β-sitosterol was the most active compound in inducing neurotoxicity at the peripheral nervous system. Together, the results presented at this work demonstrated that Prasiola crispa hexanic extract induces entomotoxic activity at Nauphoeta cinerea model. This toxic effect would be prevalente on the peripheral nervous system. The changes induced on insect grooming activity demonstrate that the extract bioactive compounds are able to reach the insect central nervous system, inducing complex behavioral changes. The cardiotoxic activity was significant, and may contribute to the development of entomotoxic activity. The presence of phytosterols compounds in the extract composition may be related to the algae toxic activity. Future phytochemical assays for the determination of novel compounds in the extract may help in the elucidation of the extract entomotoxic activity.
Keywords: Alga
Nauphoeta cinerea
Atividade entomotóxica
Neurotoxidade
Sistema nervoso
Entomotoxic activity
Neurotoxicity
Nervous system
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal do Pampa
metadata.dc.publisher.initials: UNIPAMPA
metadata.dc.publisher.department: Campus São Gabriel
metadata.dc.publisher.program: Especialização Cidades, Culturas e Fronteiras 2 ed
Citation: LORENSI, Graziela Holkem. Caracterização fitoquímica e neurofarmacológica de compostos inseticidas isolados de Prasiola crispa (Lightfoot) Kützing (1843). 2015. 98 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal do Pampa. Campus São Gabriel, São Gabriel, 2018.
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
URI: http://dspace.unipampa.edu.br:8080/jspui/handle/riu/4704
Issue Date: 5-Feb-2015
Appears in Collections:Mestrado e Doutorado em Ciências Biológicas



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