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metadata.dc.type: Dissertação
Title: Avaliação da região promotora do gene da trealase ácida atm1 e metarhizium anisopliae para construção de vetor regulável por fonte de carbono
metadata.dc.creator: Weyh, Aline
metadata.dc.contributor.advisor1: Boldo, Juliano Tomazzoni
metadata.dc.contributor.referee1: Pinto, Paulo Marcos
metadata.dc.contributor.referee2: Schrank, Augusto
metadata.dc.description.resumo: Sistemas de expressão em fungos vêm sendo utilizados em várias abordagens de análise funcional como ferramentas para alterar a expressão de genes. Em Metarhizium anisopliae, no entanto, poucos estudos têm sido conduzidos com relação a regiões promotoras homólogas eficientes e seu uso na construção de sistemas de expressão que possam facilitar tais abordagens. Este fungo entomopatogênico utilizado em biocontrole é amplamente conhecido por sua capacidade de infectar uma ampla gama de artrópodes de importância econômica, desde pragas agrícolas até vetores de doenças. Em seu processo infectivo, M. anisopliae penetra diretamente na cutícula do hospedeiro valendo-se de recursos multifatoriais que incluem a pressão mecânica exercida por apressório e a secreção de hidrolases, entre outros. Em um dos estágios de infecção, ao atingir a hemolinfa do hospedeiro, este fungo se diferencia em blastosporos e se dissemina no hospedeiro pelo sistema circulatório. A hemolinfa de artrópodes apresenta como principal componente, o dissacarídeo trealose. Para captar e utilizar este nutriente, o fungo secreta uma trealase ácida que hidrolisa a trealose em duas unidades de glicose. Em uma análise genômica, um ortólogo putativo do gene que codifica para esta hidrolase (ATM1) foi identificado em M. anisopliae. Todavia, poucos relatos na literatura fazem referência à região 5’UTR deste gene, assim como, elementos regulatórios que possam dar indícios da sua regulação. Sugere-se que elementos envolvidos na repressão catabólica por glicose estejam presentes, tal como elementos responsivos à trealose. A compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação de promotores é importante não apenas para o conhecimento básico do seu funcionamento, mas também para o desenvolvimento de ferramentas para estudar a função de genes. Vetores de expressão reguláveis são ferramentas moleculares úteis na investigação da função gênica e seu diferencial é permitir a regulação do promotor de forma a obter-se o controle mais preciso da expressão do gene em estudo. O promotor da trealase ácida, em estudo neste trabalho, provavelmente, somente é induzido na hemolinfa de hospedeiros o que permite o controle da expressão de genes de interesse em meios que mimetizem as condições encontradas na hemolinfa, em especial a presença de trealose. Este trabalho objetivou analisar a região promotora do gene da trealase ácida de M. anisopliae quanto a sua regulação por fontes de carbono. Foram construídas linhagens contendo cassetes inseridos no genoma de M. anisopliae linhagem E6 contendo os genes repórter da proteína verde fluorescente, ou do inglês GFP (green fluorescent protein), e vermelho fluorescente (yeCherry) sob a regulação de diferentes sequências da região promotora putativa de interesse. Os transformantes foram analisados quanto à indução da expressão dos genes repórter com trealose e repressão com glicose de forma quantitativa por análise do mRNA produzido (RTqPCR). Foi possível identificar uma região promotora mínima funcional de 750 pb que controla a expressão de genes repórter e pode ser induzida por trealose. Estes resultados demonstram que o promotor homólogo da trealase ácida de M. anisopliae é regulado pelas fontes de carbono testadas e oferecem uma nova ferramenta para estudos de função gênica.
Abstract: Fungal expression systems have been used in several functional analysis approaches as tools for altering gene expression. In Metarhizium anisopliae, however, few studies have been conducted regarding efficient homologous promoter and their use in constructing expression systems that may facilitate such approaches. This biocontrol entomopathogenic fungus is widely known for its ability to infect a wide range of economically important arthropod, from farming pests to disease vectors. During the infection process, M. anisopliae directly penetrates the host cuticle using multifactorial resources that include the mechanical pressure exerted by appressorium and the secretion of hydrolases, among others. In one of the stages of infection, when reaching the hemolymph of the host, this fungus differs into blastospores and is disseminated in the host by circulatory system. The hemolymph of arthropods has as main component, the disaccharide trehalose. To intake and use this nutrient, the fungus secretes acid trehalase, which hydrolyses trehalose into two glucose units. In a genomic analysis, a putative ortholog of the gene encoding this hydrolase (ATM1) was identified in M. anisopliae. However, there are few reports in literature characterizing the 5' UTR region of this gene, as well as regulatory elements that may give indications of its regulation. It is suggested that elements involved in catabolic repression by glucose are present, such as trehalose responsive elements. Understanding the mechanisms involved in promoter regulation is important not only for the basic knowledge of its functioning, but also for development tools for studying gene function. Regulable expression vectors are molecular tools useful in the investigation of gene function and their differential is to allow the regulation of the promoter in order to obtain the most precise control of the gene expression under study. The promoter of the acid trehalase, in this study probably, is only induced in host hemolymph, which allows the control of the expression of interest genes in media that mimic hemolymph conditions, especially the presence of trehalose. This work analyzed the promoter region of the acid trehalase gene of M. anisopliae and evaluated its regulation by carbon source. Strains containing cassettes inserted into the E6 strain of M. anisopliae genome containing the reporter genes green fluorescent protein (GFP) and red fluorescent (yeCherry) were obtained under the regulation of different sequences of the putative promoter region of interest. Transformants were analyzed for induction of reporter gene expression with trehalose and repression with glucose quantitatively by mRNA analysis (RT-qPCR). Was possible to identify a minimal functional promoter region of 750 bp that controls the expression of reporter genes and may be induced by trehalose. These results demonstrate that the M. anisopliae homolog acid trehalase promoter is regulated by the carbon sources tested and offer a new tool for gene function studies.
Keywords: Promotor regulável
GFP
Indução
Repressão
Fungo filamentoso
Regulatable promoter
Induction
Repression
Filamentous fungus
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal do Pampa
metadata.dc.publisher.initials: UNIPAMPA
metadata.dc.publisher.department: Campus São Gabriel
metadata.dc.publisher.program: Especialização Cidades, Culturas e Fronteiras 2 ed
Citation: WEYH, Aline. Avaliação da região promotora do gene da trealase ácida atm1 de metarhizium anisopliae para construção de vetor regulável por fonte de carbono. 2017. 62 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas). Universidade Federal do Pampa. Campus São Gabriel. São Gabriel. 2017.
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
URI: http://dspace.unipampa.edu.br:8080/jspui/handle/riu/4533
Issue Date: 28-Apr-2017
Appears in Collections:Mestrado e Doutorado em Ciências Biológicas



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