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Tipo: Trabalho de Conclusão de Curso
metadata.dc.title: Efeito entomotóxico da urease de canavalia ensiformis (jbu) e do peptídeo tóxico jaburetox (jbtx) sobre a junção neuromuscular de baratas da espécie nauphoeta cinerea
metadata.dc.title.alternative: Entomotóxico urease Canavalia ensiformis effect ( JBU ) and make jaburetox toxic peptide ( jbtx ) About Neuromuscular junction Roaches the species Nauphoeta cinerea
Autor(es): Perin, Ana Paula
Primeiro Orientador: Dal Belo, Cháriston André
Resumo: O crescimento da população mundial tem gerado a necessidade de um incremento na produtividade agrícola com uso de praguicidas ecologicamente viáveis. Nesse sentido, os compostos naturais, vem sendo estudados com a finalidade de se desenvolver produtos mais seguros para o meio ambiente e consumidores. A ampla diversidade das propriedades biológicas e físico-químicas das plantas proporcionam inúmeras aplicações, que variam da área médica, até produtos controladores de pragas agrícolas. As ureases, são enzimas, que estão envolvidas no mecanismo de defesa das plantas, possuindo propriedade entomotóxica, a qual não está relacionada com a sua atividade enzimática. Existem várias isoformas de ureases, mas o presente trabalho trata apenas da isoforma Jack Bean Urease (JBU) e do peptídeo tóxico recombinante, Jaburetox. Portanto, o objetivo do trabalho é investigar o efeito entomotóxico da urease de Canavalia ensiformis (JBU) e do peptídeo tóxico Jaburetox (Jbtx) sobre a junção neuromuscular de Nauphoeta cinerea. A expressão heteróloga do Jaburetox foi realizada em Escherichia coli e a sua purificação foi realizada em uma coluna de afinidade de níquel. Para a realização dos experimentos, baratas adultas foram utilizadas nas preparações in vivo de junção neuromuscular e in vitro, na análise da atividade da acetilcolinesterase, em homogenato de cérebro de baratas. Nossos resultados demostraram que a JBU inibe significativamente a atividade da enzima acetilcolinesterase. Quando as baratas foram tratadas com as doses de JBU 1,5; 3 e 6μg/g, houve uma inibição de 21.2 ±3%, 33±2% e 60±3% na atividade da acetilcolinesterase, respectivamente. Usando-se as mesmas doses de JBU, os ensaios eletromiográficos demonstraram que a JBU induz a um bloqueio neuromuscular tempo-dependente. Quando as doses de 1,5 e 3μg/g foram ensaiadas houve uma inibição de 30±10% e de 15±4% nas respostas contráteis, respectivamente, em 120min de registro. A administração da maior dose 6μg/g, exibiu um reforço do bloqueio neuromuscular máximo de 65±8% aos 120min de registro. A administração prévia dos animais com dexametasona (40μg/g) inibiu parcialmente (~45%) o efeito bloqueador neuromuscular da JBU (6μg/g). Os registros eletromiográficos das baratas com Jbtx, também demonstraram bloqueio neuromuscular tempo-dependente. Nestes ensaios, as doses de 2,5; 5 e 10μg/g induziram 76±16%, 68±10% e 71±8% de inibição da resposta contrátil respectivamente, em 120min de registros. Por outro lado, quando a dose de 15μg/g de animal foi ensaiada, houve apenas 22±12% de inibição da resposta contrátil. Com base nos resultados obtidos pode-se inferir que a JBU possui atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase em insetos. As doses de 1,5 e 6μg/g de JBU induzem inibição da força de contração muscular progressiva e significante em preparação neuromuscular de N. cinerea. A administração prévia de dexametasona reduz o efeito bloqueador da JBU. Além disso, o Jbtx, nas doses mais baixas (2,5; 5 e 10μg/g), também induz bloqueio na força de contração muscular em baratas. Por fim, obteve-se sucesso no processo de expressão e purificação do peptídeo Jaburetox em E. coli, obtendo-se ao final do processo, aproximadamente 330μg/mL de peptídeo. Em conclusão, esse trabalho demonstra a viabilidade da urease de Canavalia ensiformis e do peptídeo Jaburetox como praguicidas naturais, induzindo neurotoxicidade periférica em insetos-alvo.
Abstract: The growth of world population has generated a necessity of an increase in agricultural productivity using ecological pesticides. For these reasons, the natural compounds have been studied in order to develop safer products for consumers and to the environment. Plants have a range of biological and physicochemical properties that provide several possibilities of application, varying from the medical application to products for controlling the agricultural pests. Ureases are enzymes that are involved in plant defense mechanisms, showing entomotoxic properties, which are unrelated to its enzymatic activity. In addition, there are several isoforms of ureases, but this work covers only those related to the Jack Bean urease (JBU) isoform and its recombinant toxic peptide, Jaburetox. Therefore, the aim of this study was to investigate the entomotoxic effect of the Canavalia ensiformis urease (JBU) and its recombinant toxic peptide, Jaburetox (Jbtx) on the neuromuscular junction of Nauphoeta cinerea cockroach. In order to accomplish this, in vivo neuromuscular preparations of adult cockroaches were used together with in vitro assays of acetylcholinesterase activity, of the cockroach brain homogenate. The heterologous expression of Jaburetox peptide was carried out in Escherichia coli, and its purification was made by a nickel column chromatography. Thereby, our results show that JBU significantly inhibits the acetylcholinesterase (AChE) activity. When the cockroaches were treated with JBU (1.5; 3 and 6μg/g), there was an inhibition of 21.2 ±3%, 33±2% and 60±3% of AChE activity, respectively. The electromyographic assay shows that JBU induced a time-dependent neuromuscular blockage. When the 1.5 and 3μg/g doses were assayed, there was a blockage of 30±10% and 15±4% of twitch tension, respectively, after 120min of recordings. Moreover, the administration of the higher dose JBU (6μg/g) increased the neuromuscular inhibition (65±8%), after 120min of recording. Nevertheless, the pretreatment of the animals with dexamethasone (40μg/g) partially inhibited (~45%) the neuromuscular blocking effect of JBU (6μg/g). Furthermore, the electromyographic assay with Jbtx also induced a time-dependent neuromuscular blockage. Thus, when the 2.5; 5 and 10μg/g doses were assayed, there was a blockage of 76±16%, 68±10% and 71±8% on twitch tension, after 120min of recording. Even though, when the higher dose (15μg/g) was assayed, there was no significative inhibition of the neuromuscular inhibition (22±12%). Taken together, the results indicate that JBU significantly inhibits the AChE activity in insects. Additionally, JBU (1.5 and 6μg/g) induced a progressive and significant inhibition of the neuromuscular twitches of N. cinerea cockroaches. However, the pretreatment with dexamethasone decreases the JBU effect. Furthermore, Jbtx in lower doses (2.5, 5 and 10mg/g) also induced neuromuscular blockage of N. cinerea cockroach. Finally, success was achieved in the process of expression and purification of the peptide Jaburetox in E. coli, yielding in the end of the process, approximately 330μg/mL of the peptide. In conclusion, this work demonstrated the viability of Canavalia ensiformis urease and its peptide Jaburetox as natural pesticides, which induces the peripheral neurotoxicity in target insects.
metadata.dc.subject: Ureases
Praguicida
Insetos
Acetilcolinesterase
Junção neuromuscular
Pesticides
Insects
Neuromuscular junction
Ureases
Pesticides
Insects
Acetylcholinesterase
Neuromuscular junction
CNPQ: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
metadata.dc.publisher: Universidade Federal do Pampa
Campus: Campus São Gabriel
metadata.dc.identifier.citation: PERIN, Ana Paula. Efeito entomotóxico da urease de canavalia ensiformis (jbu) e do peptídeo tóxico jaburetox (jbtx) sobre a junção neuromuscular de baratas da espécie nauphoeta cinerea. 2016. 47 p. Monografia para a conclusão do curso de Biotecnologia. Universidade Federal do Pampa. São Gabriel.
metadata.dc.identifier.uri: http://dspace.unipampa.edu.br/jspui/handle/riu/360
metadata.dc.date.issued: 13-Jun-2016
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