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Tipo: Tese
Título : Efeito do consumo de hidrolisado de clara de ovo sobre as alterações neurológicas, reprodutivas e cardiovasculares promovidas pela exposição crônica ao cloreto de mercúrio (HgCl2) em ratos
Otros títulos : Effect of egg white hydrolysate intake on neurologic, reproductive and cardiovascular damage promoted by the chronic mercury chloride exposure (HgCl2) in rats
Autor(es): Rizzetti, Danize Aparecida
Primeiro Orientador: Wiggers, Giulia Alessandra
Resumo: O mercúrio (Hg) é um metal tóxico liberado para o ambiente que implica o dano oxidativo de vários sistemas biológicos. Neste contexto, os peptídeos bioativos derivados do hidrolisado protéico da clara de ovo (HCO) apresentam atividades biológicas importantes, como antioxidante, de neutralização de radicais livres, antiinflamatória, vasodilatadora e de inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA), podendo atuar em muitas doenças. Objetivo: Investigar se a ingestão de HCO é capaz de atuar sobre distúrbios neurapáticos periféricos, déficits de memória, alterações reprodutivas, disfunções hemodinâmicas e vasculares induzidos pela exposição crônica a baixas concentrações de Hg. Material e Métodos: Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos tratados durante 60 dias com: a) Controle (solução salina, i.m.); b) Mercúrio (cloreto de mercúrio, i.m. – 1ª dose de 4,6 μg/kg e doses subseqüentes de 0,07 μg/kg/dia); c) Hidrolisado (HCO, gavagem – 1 g/kg/dia); d) Hidrolisado-Mercúrio. Para avaliar o sistema nervoso periférico e central, a alodínia mecânica foi avaliada por teste de Von Frey; a hiperalgesia ao calor pelo teste plantar; a catalepsia pelo "teste do anel" modificado e a atividade locomotora espontânea por câmaras de atividade contendo células fotoelétricas. As análises foram realizadas nos tempos 0, 30 e 60 dias de tratamento. Determinações dos níveis de malondialdeído (MDA) em cérebro, MDA, grupamentos tióis (NPSH) e TNF-α em plasma e análise imunohistoquímica de pele foram realizadas após 60 dias de tratamento. O teste de memória de reconhecimento de objetos (RO) foi realizado para verificar as memórias de curto (MCP) e longo (MLP) prazo e os testes de campo aberto (CA), labirinto em cruz (LC) e retirada de cauda (RC) foram realizados como controle para experimentos comportamentais. As Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) no hipocampo foram determinadas pelo método de diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA), os níveis de MDA pela técnica de TBARS, o poder antioxidante pelo ensaio FRAP e concentração total de Hg por espectrometria de fluorescência atômica. Estudos histológicos foram efetuados em hipocampo. Para analisar o sistema reprodutor, foram realizados estudos de mobilidade e contagem espermática, produção diária de espermatozóides e estudos morfológicos. Os níveis de EROs, a peroxidação lipídica e a capacidade antioxidante foram avaliadas em testículo e epidídimo. Estudos histológicos de testículo e epidídimo e ensaio imunohistoquímico em testículo também foram realizados. Por fim, para avaliar o sistema cardiovascular, a pressão arterial sistólica (PAS) indireta foi realizada por pletismografia caudal e a PAS direta e juntamente com a pressão arterial diastólica (PAD) por canulação da artéria carótida. Os experimentos de reatividade vascular em anéis da aorta foram realizados em banho de órgãos, onde se analisou as respostas vasodilatadoras dependentes (ACh) e independentes do endotélio (NPS) e a resposta vasoconstritora à fenilefrina (Phe), na presença e ausência de endotélio, de inibidor da óxido nítrico sintase (L-NAME), do inibidor da NADPH oxidase (apocinina), de superóxido dismutase (SOD), do inibidor não-seletivo da COX (indometacina), do inibidor seletivo da COX-2 (NS 398), e do bloqueador de receptores AT-1 (losartan). A produção in situ de ânion superóxido foi avaliada em aorta pelo corante fluorescente dihidroetídio (DHE), os níveis de mRNA de SOD-1, NOX-4, p22phox, COX-2 e AT-1 por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e a expressão protéica de NOX-1 por western blot, enquanto a determinação da atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) foi avaliada em plasma pelo método fluorimétrico. Resultados: No sistema nervoso periférico, o Hg induziu uma redução do limiar de sensibilidade mecânica aos 30 e 60 dias e do limiar de sensibilidade térmica aos 60 dias. No final do tratamento também foi desenvolvida a catalepsia, porém não houve alteração significativa na atividade locomotora espontânea. O metal também aumentou os níveis de MDA em cérebro e plasma, os níveis plasmáticos de NPSH e TNF- α e o número de células de Merkel na pele. O HCO impediu o desenvolvimento de alodínia mecânica, hiperalgesia térmica e catalepsia induzida pelo Hg, como também o aumento do MDA no cérebro e no plasma e na quantidade de células de Merkel na pele. No sistema nervoso central, o Hg prejudicou a MCP e a MLP, depositou-se no hipocampo, promoveu produção de EROs e apoptose celular. O HCO preveniu os déficits de memória induzidos pelo metal, reduziu o teor de Hg, os níveis de EROs e a morte celular no hipocampo. No sistema reprodutor, o Hg diminuiu o número de espermatozóides em testículo e epidídimo, a percentagem de morfologia normal, aumentou o tempo de trânsito dos espermatozóides no epidídimo assim como os níveis de EROs, a peroxidação lipídica e a capacidade antioxidante em testículo e epidídimo. Estes efeitos foram impedidos pela ingestão de HCO. Não foram observadas alterações histológicas em tecidos testiculares, porém alterações inflamatórias foram observadas, além de alterações histológicas em nível epididimal, que foram melhoradas com o co-tratamento com HCO provavelmente devido a sua atividade antioxidante e antiinflamatória. No sistema vascular, o tratamento com Hg aumentou a PAS, a resposta vasoconstritora à Phe e reduziu a resposta vasodilatadora à ACh em aorta; aumentou o envolvimento de EROs derivados da NADPH oxidase, de prostanóides constritores da COX-2 e da angiotensina II na resposta à Phe, enquanto reduziu a modulação negativa endotelial e de NO nessas respostas. Além disso, o Hg aumentou os níveis de mRNA de NOX-4, p22phox, COX-2 e AT-1 e promoveu uma diminuição na expressão protéica de NOX-1 em aorta. Houve também aumento da atividade da ECA no plasma. O tratamento com HCO impediu as alterações promovidas pelo Hg em aorta, provavelmente pela redução da atividade da ECA e da ativação da NOX resultando na redução da produção de EROs e melhora na biodisponibilidade e NO. Conclusões: O HCO pode ser considerado um ingrediente de alimentos funcionais a ser utilizado como ferramenta terapêutica no tratamento de danos induzidos por Hg.
Resumen : Mercury (Hg) is a trace metal released into the environment implicated in the oxidative damage on several systems. In this context, the bioactive peptides from egg white hydrolysate protein (EWH) present antioxidant, free radical scavenging, anti-inflammatory, vasodilator and angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory properties and may act on many diseases. Objective: This study aims to investigate whether the EWH intake acts on neuropathic and memory disorders, reproductive changes, hemodynamic and vascular dysfunctions induced by chronic intoxication to low concentrations of Hg. Material and Methods: Four groups of 8-week-old Wistar male rats were treated for 60 days with: a) Untreated (saline solution, i.m.); b) Mercury (mercury chloride, i.m. - 1st dose 4.6 μg/kg, subsequent doses 0.07 μg/kg/day); c) Hydrolysate (EWH, gavage - 1 g/kg/day); d) Hydrolysate-Mercury. To evaluate the peripheral nervous system, mechanical allodynia was assessed using Von Frey Hairs test; heat hyperalgesia by the plantar test; catalepsy by a modification of the “ring test” and spontaneous locomotor activity by a photocell activity chambers. Analyses were performed at 0, 30 and 60 days of treatment. Brain and plasma MDA, plasma NPSH and TNF-α determination and skin immunohistochemistry were performed at 60 days. To investigate central nervous system, object recognition memory test (OR) was performed to verify Short (STM) and Long-Term Memory (LTM) and Open Field (OF), Plus Maze (PM) and Tail Flick (TF) tests were performed as control for behavioral experiments. Reactive Oxygen Species (ROS) in hippocampus were determined by dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) method, malondialdehyde (MDA) levels by TBARS, antioxidant power by FRAP assay and total Hg concentration by atomic fluorescence spectrometry. Histological studies in hippocampus were carried out in formaldehyde fixed sections. To analyze the reproductive system, sperm motility and count, daily sperm production and morphological studies were performed. ROS levels, lipid peroxidation and antioxidant capacity were assessed in testis and epididymis. Histological studies on testis and epididymis and immunohistochemical assay in testis were also carried out. Finally, to assess the cardiovascular system, indirect systolic blood pressure (SBP) was performed by tail-cuff plethysmography and direct SBP and diastolic blood pressure (DBP) by carotid cannulation. The vascular reactivity experiments in aorta rings were performed in an organ bath, where we analyzed the endothelial dependent and independent vasodilator responses to acetylcholine (ACh) and sodium nitroprusside (SNP) and the vasoconstrictor response to phenylephrine (Phe) in the presence and absence of endothelium, in the presence of NOS inhibitor (L- NAME), NADPH oxidase inhibitor (apocynin), superoxide dismutase (SOD), non-selective COX inhibitor (indomethacin), selective COX-2 inhibitor (NS 398), AT-1 receptors blocker (losartan). In situ superoxide anion production by the oxidative fluorescent dye dihydroethidium (DHE), SOD-1, NOX-4, p22phox, COX-2 and AT-1 mRNA levels by the quantitative PCR real time (qRT-PCR) and NOX-1 expression by the western blot were also performed in aorta tissue while the determination of angiotensin converting enzyme (ACE) activity by fluorimetric method was measured in plasma. Results: At peripheral and central nervous system, Hg induced a reduction in mechanical sensitivity threshold at 30 and 60 days and in thermal sensitivity threshold at 60 days. At the end of treatment catalepsy was developed, but there was not significant alteration in spontaneous locomotor activity. Hg also increased brain and plasma MDA, plasma NPSH and TNF- α levels and the number of Merkel cell–neurite complex in the skin. EWH prevented the development of mechanical allodynia, thermal hyperalgesia and catalepsy induced by Hg and the increase in MDA concentration in brain and plasma and in the number of Merkel cell–neurite complex in the skin. Indeed, we confirmed that the STM and LTM were impaired in adult rats exposed to Hg at low concentrations and proved that this damage is related to increased metal deposition and subsequent ROS production and apoptosis in hippocampus. In addition, we demonstrated for the first time that EWH treatment is able to prevent memory impartment induced by Hg exposure reducing Hg content, ROS production and cell death in hippocampus. At reproductive system, Hg decreased the testicular and epididymal sperm number, as well as increased sperm transit time in epididymis. The metal also diminished the percentage of morphologically normal spermatozoa compared with untreated group. This harmful effect was prevented by the EWH intake, and the Hydrolysate-Mercury group showed normal sperm function. HgCl2-treatment also increased ROS levels, lipid peroxidation and antioxidant capacity in testis and epididymis. In addition, inflammatory alterations in testis and histological changes in testicular and epididymal tissues were observed. EWH improved histological and immunohistochemical changes, probably due to antioxidant and anti-inflammatory activities. At vascular system, Hg treatment resulted in an increase in SBP, aortic vasoconstrictor response to Phe and a decrease in vasodilator response to ACh; the increased involvement of ROS from NADPH oxidase, constrictor prostanoids, mainly from COX-2 and angiotensin II in response to Phe, whereas the endothelial NO modulation of such responses was reduced; an increase in the NOX-4, p22phox, COX-2 and AT-1 mRNA levels and a decrease in the NOX-1 expression in aorta and increased ACE activity in plasma. Treatment with EWH prevented the increase in SBP and Phe responses and the endothelial dysfunction elicited by Hg in aorta. These vascular improvements were related to the decreased ACE activity and NOX isoforms activation by the EWH intake, resulting in alleviated ROS production and increased NO bioavailability in aorta. Conclusions: The EWH could be considered an ingredient for functional foods and could be used as alternative or complementary treatment tools for Hg-induced damage.
Palabras clave : Mercúrio
Hidrolisado de Clara de Ovo
Sistema Nervoso Central
Sistema Reprodutor Masculino
Sistema Cardiovascular
Mercury
Egg white hydrolysate
Central and Peripheral Nervous System
Male Reproductive System
Cardiovascular System
Bioquímica
Editorial : Universidade Federal do Pampa
Campus: Campus Uruguaiana
Citación : RIZZETTI, Danize Aparecida. Efeito do consumo de hidrolisado de clara de ovo sobre as alterações neurológicas, reprodutivas e cardiovasculares promovidas pela exposição crônica ao cloreto de mercúrio (HgCl2) em ratos. 233 p. Tese (Doutorado em Bioquímica) – Universidade Federal do Pampa, Uruguaiana, 2016.
Tipo de acesso: Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
Licença: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
URI : https://repositorio.unipampa.edu.br/jspui/handle/riu/1658
Fecha de publicación : 2016
Aparece en las colecciones: Doutorado em Bioquimica

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