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metadata.dc.type: Dissertação
Title: Clonagem e expressão Datransposase mos1 de Drosophila simulans e o desenho in silico de um vetor para expressão heteróloga de proteínas
metadata.dc.creator: Tapia, Jéssica Silva
metadata.dc.description.resumo: A importância da expressão de proteínas de forma heteróloga tem crescido surpreendentemente, tendo em vista a progressiva necessidade de sua produção para aplicações na indústria farmacêutica, para uso terapêutico, ou uso comerciais, e estudo de estrutura e função. No entanto, a expressão das proteínas pode ser limitada por diversos fatores, podendo apresentar diversas dificuldades como a formação de corpos de inclusão ou proteínas com conformação incorreta, por exemplo. Estudos em hospedeiro para expressão de proteínas heterólogas tem sido desenvolvido, a fim de otimizar fatores como temperatura e concentração de indutor, com o intuito de melhorar a qualidade das proteínas obtidas. Neste estudo, inicialmente objetivou-se otimizar a expressão da transposase do elemento mariner mos1, em diferentes cepas de Escherichia coli BL21(DE3), E. coli BL21 (DE3) pLysS, E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RP; E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL; E. coli BL21(DE3) pT-GROE, usando para subclonagem o vetor plasmidial de expressão pGEX-4T1. Analisando o melhor sistema de expressão para este elemento em particular, comparando as temperaturas de 30°C e 37°C para expressão e utilizando concentrações de 0,1mM; 0,5mM e 1,0mM de IPTG. Mesmo obtendo sucesso na expressão, com todas as condições de IPTG e em ambas as temperaturas testadas, o sistema de expressão não foi eficaz para obter proteínas de forma solúvel. Frente a este problema procuramos desenvolver um vetor de expressão de proteínas heterólogas que afim de tornar este processo mais rápido e mais eficiente, utilizando apenas um evento de clonagem e de transformação da bactéria de expressão. O vetor para expressão foi desenhado in silico a partir de um promotor Lac responsivo a IPTG, seguido por um sinal de exportação celular (peptídeo-sinal), um fragmento Strep-tagII para purificação e um sítio para trombina, permitindo a clivagem da proteína de interesse dos tags fusionados. Foram inseridos dois sítios para endonucleases de restrição (BamHI e XbaI) que permitem a clivagem do gene clonado no constructo. Desta forma demonstramos que todas as cepas foram eficazes na expressão da transposase mos1, sendo a temperatura mais adequada de 37°C em todas as concentrações de IPTG, já que não houve nenhuma diferença quanto a mudança deste fator. Apresentamos um novo vetor de expressão de proteínas heterólogas, com a finalidade de facilitar a obtenção de proteínas heterólogas purificadas, tais problemas encontrados durante a tentativa de expressão da transposase.
Abstract: The importance of heterologous protein expression has surprisingly grown in view of the progressive need for its production for applications in the pharmaceutical industry, for therapeutic use, or commercial use, and study of structure and function. However, the expression of the proteins may be limited by several factors, and may present several difficulties such as the formation of inclusion bodies or proteins with incorrect conformation, for example. Host studies for expression of heterologous proteins have been developed in order to optimize factors such as temperature and concentration of inducer in order to improve the quality of proteins obtained. In this study, we initially aimed to optimize transposase expression of the mariner element mos1 in different strains of Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) pLysS, E. coli BL21CodonPlus (DE3) -RP; E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL; E. coli BL21 (DE3) pTGROE, using for subcloning the pGEX-4T1 expression plasmid vector. Analyzing the best expression system for this particular element, comparing the temperatures of 30°C and 37°C for expression and using concentrations of 0.1 mM; 0.5mM and 1.0mM IPTG. Even with expression success, with all IPTG conditions and at both temperatures tested, the expression system was not effective in obtaining proteins in a soluble form. In view of this problem we have tried to develop an expression vector of heterologous proteins in order to make this process faster and more efficient, using only one event of cloning and transformation of the expression bacterium. The vector for expression was drawn in silico from an IPTG responsive Lac promoter, followed by a cell export signal (peptide-signal), a Strep-tagII fragment for purification and a site for thrombin, allowing cleavage of the protein from Interest of merged tags. Two sites for restriction endonucleases (BamHI and XbaI) were inserted which allow the cleavage of the cloned gene in the construct. In this way, we demonstrated that all strains were effective in the expression of the transposase mos1, with the most suitable temperature being 37 ° C in all concentrations of IPTG, since there was no difference in the change of this factor. We present a new expression vector of heterologous proteins, in order to facilitate the obtaining of purified heterologous proteins, such problems encountered during the attempt to express the transposase.
Keywords: Drosophila
DNA
Gene Cloning
Publisher: Universidade Federal do Pampa
metadata.dc.rights: Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
metadata.dc.rights.uri: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
URI: http://hdl.handle.net/riu/1464
Issue Date: 10-Mar-2016
Appears in Collections:Mestrado e Doutorado em Ciências Biológicas



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